bacterio-virologie

Introduction:

Tous les microorganismes se multiplient à partir des nutriments présents dans le milieu de culture. Ils ont besoins d’eau, de sources d’énergie, de carbone, d’azote et de minéraux.
Les facteurs de croissance sont des métabolites essentiels apportés au cours de leur croissance. Ils sont différents selon la nature des besoins. Ces besoins dépendent des types trophiques.

I.                         Besoins nutritifs courants des bactéries

95% du poids sec des bactéries est composé de carbone, d’oxygène, d’hydrogène, d’azote, de soufre, de phosphore, de potassium, de magnésium et de fer. Ce sont les macroéléments.
 Le carbone, l’oxygène, l’hydrogène, l’azote, le soufre et le phosphore sont les constituants des glucides, les lipides, les protéines et les acides nucléiques.

Le potassium, le calcium, le magnésium et le fer existent à l’état de cations.

Potassium        : nécessaire à l’activité des enzymes

Calcium           : contribue à la thermo-résistance des bactéries

Magnésium      : cofacteur de nombreuses enzymes, forme un complexe avec l’ATP, stabilise les ribosomes et les membranes cellulaires.

Fer       : Synthèse des cytochromes, cofacteur d’enzymes et des transporteurs d’e^-.

1)                                          Besoin en oligoéléments

Ce sont le manganèse, le zinc, le cobalt, le molybdate, le nickel et le cuivre.
La plupart des cellules nécessite ces oligoéléments en quantité faible.

Les besoins en éléments majeurs sont de l’ordre du g/L.
Les besoins en éléments mineurs sont de l’ordre du mg/L.
Les besoins en oligoéléments sont de l’ordre du μg/L.

La plupart des microorganismes vont avoir des besoins spécifiques selon leur morphologie et leur environnement (par exemple, les diatomées ont besoin de silice et les bactéries de lacs salins ont besoin de fortes concentrations en ions sodiques).

2)                                          Besoin en carbone, oxygène et hydrogène

Le carbone :
Il est nécessaire à la formation du squelette de toute molécule organique.
Les molécules servant de source de carbone apportent souvent l’oxygène et l’hydrogène, sauf dans le cas du CO₂.
La plupart des microorganismes peut absorber le CO₂, le réduire et l’incorporer dans des molécules organiques.
Les organismes qui utilisent le CO₂ comme principale source de carbone sont des organismes autotrophes.
C’est un mécanisme très coûteux en énergie, donc les microorganismes se développent grâce à des molécules complexes plus réduites.
Les organismes capables d’utiliser ces molécules sont des hétérotrophes. Ils utilisent ces molécules comme sources de carbone et d’énergie.
Ils ont une grande flexibilité en ce qui concerne les sources de carbone, ils ont donc des besoins nutritifs très différents selon les espèces.
Au sein d’une même espèce, il y a des mutations qui permettent d’utiliser des sources de carbones différentes.
Un organisme qui utilise la même source de carbone que la majorité de son espèce est un organisme prototrophe.
Un mutant prototrophe qui a perdu la capacité de synthétiser un nutriment essentiel et auxquels on doit fournir cet élément est appelé auxotrophe.

Types nutritionnels :
Tout organisme a besoin de sources d’énergie, d’hydrogène et d’électrons pour sa croissance.
Il y a 2 sources d’énergie possible : l’énergie lumineuse captée durant la photosynthèse et l’énergie provenant de l’oxydation des molécules organiques et inorganiques.

Les classes d’organismes :
- Les phototrophes qui utilisent la lumière comme source d’énergie.
- Les chimiotrophes qui utilisent l’oxydation des composés chimiques organiques ou inorganiques.
- Les lithotrophes qui utilisent les substances inorganiques réduites comme source d’énergie.
- Les organotrophes qui extraient les électrons et l’hydrogène des composants organiques.

On fait un classement en 4 classes nutritionnelles sur la base des sources primaires en énergie, en hydrogène, et/ou en électron et en carbone.

Catégories nutritionnelles :
- Autotrophes et photolithotrophes : ils utilisent l’énergie lumineuse et un donneur inorganique d’hydrogène et le CO₂ comme source de carbone. Par exemple les microalgues, les bactéries sulfureuses pourpres ou vertes et les cyanobactéries.
- Hétérotrophes photoorganotrophes : Ils utilisent l’énergie lumineuse, un donneur organique d’hydrogène et une source organique de carbone. Par exemple les bactéries non sulfureuse pourpre et verte.
- Autotrophes chimiolithotrophes : Ils utilisent des sources chimiques d’énergie, un donneur inorganique d’hydrogène et le CO₂ comme source de carbone. Par exemple les bactéries qui oxydent le soufre, qui oxyde l’hydrogène, les bactéries nitrifiantes et les bactéries du fer.
- Hétérotrophes chimioorganotrophes : Ils utilisent une source chimique d’énergie, un donneur organique d’hydrogène et des sources organiques de carbone. Par exemple les protozoaires et les bactéries non photosynthétiques.

Il existe aussi des bactéries qui utilisent des sources inorganiques pour l’énergie et organique pour le carbone : ce sont des organismes mixotrophes.

3)                                          Besoins en azote, phosphore et soufre

Les microorganismes ont besoin de grandes quantités d’azote, de phosphore et de soufre pour leur croissance. La plupart du temps les sources sont inorganiques.

- L’azote sert à la synthèse des acides aminés, des bases puriques et pyrimidiques, de certains glucides, lipides et cofacteurs enzymatiques.
- Le phosphore sert à la synthèse des acides nucléiques, des phospholipides, des nucléotides, de certains cofacteurs, de certaines protéines et d’autres composants cellulaires.
- Le soufre sert à la synthèse de la cystéine et de la méthionine, de quelques glucides, de la biotine et de la thiamine.

4)                                          Facteurs de croissance

En complément des éléments de bases, certaines bactéries exigent pour leur développement la présence de substances organiques qu’elles sont incapables de synthétiser, ce sont les facteurs de croissance.

■ Nature

Les facteurs de croissances sont des facteurs limitants de la croissance, ils agissent spécifiquement et englobent 3 catégories de substances :

- Les acides aminés : ils ont un rôle dans la synthèse des protéines (actives à 25 mg/L).
- Les bases puriques et pyrimidiques : élaborations des acides nucléiques (actives à 10 ng/L).
- Les vitamines : précurseurs et/ou coenzymes (actives à 1 à 24 μg/L).

■ Dosage microbiologique des facteurs de croissance

La croissance d’un microorganisme exigeant un facteur de croissance peut être proportionnel à la concentration de ce facteur.
La connaissance de cette relation de cette proportionnalité permet le dosage par voie microbiologique.

Syntrophie :
Les besoins en facteurs de croissance d’une espèce microbienne peuvent quelques fois être satisfait par la présence d’une espèce qui le synthétise.

5)                                          Absorption des nutriments

La première étape est l’absorption par la cellule microbienne.
C’est un mécanisme d’absorption spécifique car seules les substances nécessaires sont absorbées.
La plupart des microorganismes vivent dan des endroits pauvres en nutriments. Ils doivent être capables de transporter les nutriments dans la cellule à partir de solutions très diluées et souvent contre le gradient de concentration.
Les molécules doivent traverser la membrane plasmique sélective qui, souvent, empêche le libre passage de la plupart des substances.

a)                                          Diffusion facilité

Diffusion facilitée :
Les molécules se déplacent d’une région de concentration élevée vers une région de concentration faible, grâce à l’agitation thermique.
La vitesse de diffusion passive dépend du gradient de concentration entre l’intérieur et de l’extérieur de la cellule. Elle décroît au fur et à mesure que le nutriment est absorbé, à moins qu’il ne soit utilisé immédiatement par la cellule.
La vitesse de diffusion est augmentée grâce à la présence de perméase.
Dans le cas d’une diffusion médiée par un transporteur, on pale de diffusion facilitée.
Grâce aux perméases, la vitesse va augmenter avec le gradient de concentration et cela même à de faibles concentrations de nutriments.
Les transporteurs ressemblent aux enzymes par leur spécificité pour le substrat à transporter.
Chaque transporteur est sélectif et ne véhicule que des solutés apparentés. C’est un processus qui ne nécessite aucune enzyme supplémentaire et, si le gradient de concentration disparaît, le mouvement des molécules vers l’intérieur s’arrête.
Les microorganismes sont souvent dans des habitats qui sont des sources nutritives très diluées. Pour se développer, ils doivent être capables de transporter et de concentrer ces nutriments. Le mécanisme de diffusion facilitée n’est pas toujours suffisant donc il existe le transport actif et la translocation de groupe.

b)                                          Transport actif

C’est le transport de molécules de solutés contre un gradient de concentration, il y a utilisation d’énergie métabolique et nécessité de protéines de transport.
Il y a une grande spécificité des transporteurs.
Des molécules de solutés similaires peuvent entrer en compétitions pour les même protéines de transport dans la diffusion passive et dans le transport actif.
La saturation du transporteur est possible à des concentrations élevées en soluté.
Des inhibiteurs métaboliques qui bloquent la production d’énergie inhibent le transport actif mais n’affecte pas la diffusion facilitée.

Les bactéries utilisent aussi la force motrice pour le transport actif :
■ Cotransport de 2 substances différentes dans le même sens, c’est le symport. L’énergie emmagasinée sous la forme d’un gradient de protons est utilisée pour le transport de la molécule en solution. Ce système sert à importer des acides aminés et des acides organiques.
■ Système antiport : Les substances se déplacent en sens opposé. Ce système sert à importer des sucres et des acides aminés.

Un microorganisme ne possède pas qu’un seul système de transport pour un seul nutriment. Cette diversité donne à l’organisme un avantage compétitif supplémentaire dans un environnement variable.

c)                                          La translocation de groupe

C’est un processus au cours duquel une molécule est transférée dans la cellule en étant modifiée chimiquement.

Par exemple, le système de la phosphotransférase des sucres (PTS) transfère une variété de sucres dans les cellules procaryotes en les phosphorylant et en utilisant le PEP comme donneur de phosphate.

PEP + sucre(extérieur) → pyruvate + sucre- (intérieur)

d)                                          La capture du fer

Le fer est nécessaire pour les cytochromes et les enzymes. La capture du fer est difficile car les ions Fe³⁺ et leurs dérivés sont très insolubles.

La solution est que les bactéries et les mycètes sécrètent des sidérophores. Ce sont des molécules de faible masse moléculaire qui complexent les ions ferriques et les fournissent à la cellule.

Quand le complexe sidérophore-fer a atteint la surface de la cellule, il se lie à une protéine réceptrice du sidérophore. Le fer est ensuite libéré pour entrer directement dans la cellule ou alors tout le complexe sidérophore-fer est transporté dans la cellule. Une fois entrer dans la cellule, le fer réduit e ions ferreux (Fe²⁺). Le fer est tellement essentiel que les microorganismes utilisent souvent plus d’une voie pour l’absorber en quantité suffisante.

6)                                          Les milieux de culture

Le maintien et la croissance des microorganismes en laboratoire ne sont possibles que si des milieux de culture adéquats sont disponibles.
Il faut des milieux de culture spéciaux pour l’isolement, l’identification ou en microbiologie industrielle. La composition d’un bon milieu dépend de l’espèce à cultiver.

Généralités

■ Milieux liquides, milieux solides
Les microorganismes troublent uniformément les milieux liquides ou encore forment des agglomérats, des dépôts, des voiles superficiels.
Sur un milieu solide, ils peuvent former une nappe confluente. Si les cellules bactériennes ont été isolées, leurs descendants s’accumulent en masses souvent bien délimitées (colonies) et dont l’aspect, les dimensions, les contours, la structure sont autant de caractères précieux qui permettent son identification.
L’état solide est obtenu en présence d’un polyoside (agar-agar ou gélose) extrait d’algues à une concentration de 15%.

■ Composition des milieux de culture
Ils doivent fournir les éléments essentiels à la croissance et souvent des facteurs de croissance. Ils sont le plus souvent isotoniques (NaCl 9‰) et de pH de 7 à 7,6.

On distingue 3 types de milieux :
-  Les milieux naturels ou empiriques
Ils sont de composition mal définie. Le plus simple est le bouillon nutritif composé d’extrait de viande de bœuf (5g) + peptone (10g) + NaCl (5g) + 1L d’eau distillée. L’extrait de viande de bœuf contient des glucides, des composés azotés, des vitamines hydrosolubles et des sels minéraux.
Les peptones résultent de la digestion enzymatique ou chimique de matières protéiques (viandes caséine ou gélatine). Elles contiennent des peptides et acides aminés.
- Les milieux synthétiques
La composition de ces milieux est chimiquement définie. En raison de leurs difficultés de préparations, ils ne sont utilisés que dans les cas indispensables, comme l’étude de besoins nutritionnels d’une bactérie ou encore les dosages de facteurs de croissance.
- Les milieux semi-synthétiques
Ils contiennent en plus certains composants favorisants la croissance comme l’extrait de levure.

Recherche et identification des bactéries et des champignons

Les milieux peuvent être classés en fonction de leur utilisation :

-                     Les milieux sélectifs
Ils permettent la croissance de microorganismes que l’on cherche en inhibant le développement des autres germes. Ils contiennent des agents sélectifs que l’on appelle encore des inhibiteurs tel le cristal violet, le vert brillant, les sels biliaires, les antibiotiques.
Les agents sélectifs de ces milieux agissent sur la vitesse spécifique maximale de croissance qui est diminuée pour tous les germes ; Peu ou moyennement pour ceux qui seront sélectionnés, et, beaucoup et même totalement pour ceux qui seront inhibés.

2. Les milieux d’enrichissements
Ces milieux contiennent des agents sélectifs et sont destinés à enrichir le milieu en germes recherchés.
Le milieu agit par ses composés spécifiques sur la vitesse spécifique maximale de croissance. Celle des germes recherchés sera peu touchée, celle des autres sera diminuée. Le rapport des germes recherchés sur les germes autres augmente.

3. Les milieux d’isolement et d’identification :

Milieux d’isolement :
Ce sont des milieux solides de composition simple sur lesquels de nombreux microorganismes peuvent se développer. Le plus répandu est la gélose nutritive préparée à partir d’un bouillon nutritif et d’agar. Les bactéries disséminées à la surface d’une gélose nutritive forment autant de colonies qu’il y avait initialement de cellules. Ces colonies lorsqu’elles sont isolées permettent de préparer des cultures pures : elles sont le point de départ d’une étude systématique aboutissent à l’identification.
Pour les levures et les moisissures, le milieu « pomme de terre – glucose » et le milieu « ….. – glucose » sont les plus répandus.

Milieux d’identification :
Ils servent à mettre en évidence une ou plusieurs propriétés chez un microorganisme précédemment isolé. Ils existent en grand nombre : certains permettent de rechercher l’utilisation ou la fermentation d’un sucre, la production de gaz, la formation d’indole, d’acétylméthylcarbinol.
D’autres servent à démontrer la présence d’une enzyme.

Caractères culturaux
L’aspect macroscopique des cultures sur un milieu solide constitue encore une part importante de l’identification d’un microorganisme.

-                     Bactéries
Sur un milieu solide après culture en surface, on peut caractériser les bactéries selon un aspect des colonies formées. Plusieurs peuvent alors envisager :
- La taille
- La forme : punctiforme, ronde régulière, dentelée irrégulière (striation radiale ou concentrique)
- L’aspect : il peut y avoir des colonies rugueuses ou « R » à surface irrégulière, des colonies lisses ou « S » à surface lisse, brillante et régulière ou des colonies muqueuses ou « M » à l’aspect gras et coulant.
- L’éventuel envahissement du milieu
- Le volume : colonies bombées ou plates, étalées
- La couleur : selon l’élaboration d’un pigment

2. Levures
Les critères d’identification sont les même que pour les bactéries. Cependant, certains milieux peuvent aider à la mise en évidence de caractères culturaux.

3. Les moisissures
Dans ce cas, on travaille sur un milieu solide ensemencé par « touche » et sur milieu pauvre pour éviter le risque de perte de caractères culturaux.
Les critères sont examinés à l’œil nu ou à la loupe binoculaire et sont :
- La vitesse de croissance
- La couleur et les variations en fonction du temps
- La couleur de l’envers des cultures
- La texture de la surface
- Les éventuels changements de couleur du milieu

II.                         Croissance

-                     La croissance est l’augmentation des constituants cellulaires et peut se traduire par une augmentation de la taille des microorganismes, du nombre d’organismes ou les 2.

-                     Lorsque les microorganismes se développent en système fermé, la croissance n’est pas exponentielle que pendant plusieurs générations : ensuite, elle entre dans une phase stationnaire (résultant de la limitation des éléments nutritifs et de l’accumulation des déchets).

-                     Lorsque les microorganismes se développent à système ouvert avec apport continu de nutriment et élimination des déchets, la phase exponentielle peut être maintenue très longtemps.

-                     De nombreuses techniques existent pour étudier la croissance bactérienne en suivant les changements du nombre total de cellules, du nombre de microorganismes viables ou de la masse cellulaire.

-                     La disponibilité en eau, le pH, la température, la concentration en oxygène, la pression, les radiations, entre autres, influencent la croissance bactérienne.

1)                                          Mesures de la croissance

Plusieurs moyens de mesurer la croissance microbienne pour déterminer le temps de génération et la vitesse de croissance. Le nombre ou la masse cellulaire de la population peut être suivi puisqu’ils augmentent tous deux au cours de la croissance.

a)                                            Mesure du nombre de cellules

L’utilisation d’une chambre de comptage est facile, peu coûteuse et rapide. Elle donne des informations sur la taille et la morphologie des organismes.
Pour les bactéries, on utilise des chambres de comptage de Petroff-Hausser.
Pour les microorganismes eucaryotes plus grands, on utilise des hémocytomètres.

Le nombre de microorganismes est calculé en tenant compte du volume de la chambre et de la dilution de l’échantillon.
Les algues, les protozoaires et les levures non filamenteuses sont comptés directement à l’aide de compteurs Caultien. Les cellules sont comptées par résistance électrique. Cette méthode donne des résultats très précis. Les limites de la méthode sont qu’il est impossible de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.

Il existe aussi des techniques pour dénombrer les enzymes viables, capables de se développer.
Un échantillon dilué de microorganismes est étalé sur une surface solide et chaque microorganisme se développe en une colonie distincte.
Le nombre de colonie peut être calculé et est exprimé en termes d’unités formatrices de colonies (UFC).Le nombre de microorganisme est souvent déterminé à partir de colonies se développent sur des filtres spéciaux à pores suffisamment petits pour ne pas laisser passer les cellules. Un échantillon est filtré sur une membrane filtrante spéciale. Le filtre est ensuite déposé sur un milieu gélosé jusqu’à ce que chaque cellule forme une colonie séparée.

b)                                            Mesure de la masse cellulaire

La croissance d’une population est accompagnée d’une augmentation de la masse cellulaire totale aussi bien que du nombre de cellule. Les techniques mesurant des variations de la masse cellulaire permettent donc de suivre la croissance.
L’approche la plus directe est la détermination du poids sec des microorganismes. Les cellules se développent dans un milieu liquide sont récoltés par centrifugation, lavées, séchées dans un four puis pesées.

Des techniques plus directes sont basées sur le fait que les cellules bactériennes dispersent la lumière incidente et la quantité de lumière difractée est proportionnelle à la concentration de cellule. La mesure se fait au spectromètre et une relation linéaire existe entre la concentration bactérienne et l’absorbance.

2)                                          Les rendements de croissance et les effets d’un élément nutritif limitant

Quand la croissance microbienne est limitée par la faible concentration d’un élément nutritif essentiel, la croissance nette finale au rendement en cellule augmente avec la quantité de nutriments limitant.
La vitesse de croissance augmente aussi avec la concentration en facteurs nutritifs mais d’une façon hyperbolique. Au niveau de nutriments suffisamment élevés, la vitesse de croissance n’augmente plus d’avantage avec l’élévation de concentration en nutriment.

La masse microbienne produite à partir d’un nutriment s’exprime quantitativement comme le rendement de croissance (Y).

y = (masse de microorganismes formés)/(masse de substrat consommé)

Y est exprimé en gramme de cellules formées par gramme de substrat utilisé : c’est le rendement de croissance molaire.
C’est un indice de conversions des éléments nutritifs en matériel cellulaire.
Les microorganismes aérobies en milieu riche peuvent assimiler 20 à 50% de sucres absorbés. En milieu dilué, quelques bactéries sont capables d’augmenter leur efficacité et assimilent jusqu’à 80% des sucres absorbés.

3)                                          La  culture continue de microorganismes

Il est possible de cultiver des microorganismes dans un système ouvert, où les conditions de culture sont maintenues constantes par l’apport continu de nutriments et élimination des déchets. Ces conditions sont réalisées en laboratoire dans des systèmes de culture continue où une population microbienne peut être maintenue longtemps en phase exponentielle de croissance et à une concentration de la biomasse.

Ces systèmes permettent de produire une quantité constante de cellules en phase exponentielle tout en se multipliant à une vitesse connue.
Deux types de systèmes de culture continue sont généralement utilisés : le chemostat et le turbidostat.

■ Le chemostat
Il est construit de telle façon que le milieu stérile soit introduit dans la chambre de culture à la même vitesse que le milieu contenant les microorganismes est éliminé.
Le milieu de culture contient un élément nutritif essentiel en quantité limitante et la vitesse de croissance est déterminée par la vitesse à laquelle le milieu frais est ajouté dans la chambre de culture et la densité cellulaire finale dépend de la concentration en nutriment limitant.
La vitesse d’échange du nutriment est exprimée sous forme de vitesse de dilution (D), vitesse à laquelle le milieu passe au travers de la chambre de culture par rapport au volume de la cuve, où f est la vitesse d’écoulement (en ml/h) et V est le volume du récipient (en ml).
                                                          
La densité de la population microbienne et le temps de génération sont tous deux liés à la vitesse de dilution.
(fig. 6.13)

Lorsque la vitesse de dilution augmente, la densité de la population microbienne reste inchangée pour une gamme plus large de vitesses de dilution. Le temps de génération devient plus court lorsque la vitesse de dilution s’élève. Le nutriment limitant sera presque complètement consommé dans ces conditions d’équilibre. Si la vitesse de dilution est trop élevée, les microorganismes peuvent être éliminés dans la chambre avant de s’être divisés, ceci parce que la vitesse de dilution est plus grande que la vitesse de croissance. La concentration en nutriment limitant augmente à des vitesses de dilution élevées, moins de microorganismes étant présents pour l’utiliser.

A des vitesses de dilution faible, une augmentation de D provoque une augmentation à la fois de la densité cellulaire et la vitesse décroissante (fig. 6.11b)
Un apport limité de nutriment est disponible à des vitesses de dilution faible. L’énergie disponible doit servir à l’entretient de la cellule et non à la croissance et à la division. Quand la vitesse de dilution augmente, la quantité d’élément nutritif augmente ainsi que la densité cellulaire car l’énergie est disponible  à la fois pour l’entretient de la cellule et la croissance. La vitesse de croissance augmente quand l’énergie totale disponible dépasse l’énergie d’entretient.

■ Le turbidostat
Il est équipé d’une cellul